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Association Française des Techniques Hydrothermales

 

 

 

 Association Française des Techniques Hydrothermales ARCHIVES

Recherche de Légionelles par PCR

Caractères bactériens

La mise en évidence des bactéries peut reposer sur deux types de caractères

- Le phénotype :

- ensemble de caractères observables, influencés par l’environnement de la bactérie
- objectivés par la culture, l’isolement, la morphologie, les tests biochimiques et immunologiques …

- Le génotype :

- ensemble des constituants génétiques, exprimés ou non, déterminant partiellement le phénotype
- portés par l’ADN et les gènes

Méthode phénotypique

La mise en culture

- Filtration sur membrane, concentration
- Ensemencement de milieux
- Incubation et multiplication

Lecture et sélection des colonies

Étapes d’identification

- Repiquage sur milieux différentiels
- Tests immunologiques

Méthode génotypique : la PCR

Filtration, concentration

Extraction et purification de l’ADN

Amplification de la séquence cible de l’ADN

- Spécifique du genre Legionella spp
- Spécifique de l’espèce Legionella pneumophila

Quantification des séquences amplifiées

Durée totale de 8 à 48h

Bases théoriques

Reproduire la réplication naturelle de l’ADN

- En ciblant une zone
- En fournissant les amorces, les enzymes et les oligonucléotides nécessaires
- En répétant le cycle entre 30 et 50 fois

PCR quantitative en temps réel (qRT -PCR)

Utilisation d’un indicateur fluorescent de la production des amplicons durant chaque cycle

L’augmentation du signal est proportionnelle à la quantité des produits de PCR

Caractéristiques des deux méthodes

Culture qRT -PCR
Multiplication des bactéries viables et cultivables Amplification de l’ADN des bactéries viables cultivables ou non
et des mortes intègres
Numération en UFC/l Quantification en UG/l Plus souvent positive
Signal > culture
Mal corrélée à la culture
Limite détection 50 UFC/l
Limite quantification 250 UFC/l
Limite détection 30 à 200 UG/l
Limite quantification 100 à 500 UG/l
Faux négatifs possibles 
Du fait de la technique :
- sélectivité des milieux et des traitements
- absence de test d’identification de toutes les espèces
Du fait de l’échantillon :
- présence de flore interférente
- perte de cultivabilité des souches (stress)
Faux négatifs rares
Du fait de la technique :
- défaut d’extraction,
- défaut de purification
Du fait de l’échantillon :
- présence d’inhibiteurs
Éliminés par contrôles internes
Grande fiabilité des résultats négatifs
  Détecte l’ensemble des espèces de Legionella
Bonne prédictivité du risque sanitaire Prédictivité du risque sanitaire inconnue
Niveaux d’alerte et réglementaires établis par cette méthode
Plus représentative du caractère infectieux des souches ?
Aucun niveau de risque établi par cette méthode
Rend compte des BVNC qui peuvent conserver leur caractère infectieux ?
Isolement de la souche pour enquête épidémiologique
Sérotypage possible de L. pneumophila
Constitue donc un complément de la méthode par culture Contrôle sanitaire

Application au LHE

Analyse d’échantillons d’eau mise en oeuvre

- depuis plus de 5 ans par PCR traditionnelle
- en qRT-PCR depuis 2 ans

Utilisée à visée de recherche car méthode non « officielle » pour la surveillance des eaux (note DGS du 3 mars 2005)

Demandes ponctuelles des DDASS ou de certains établissements à visée prédictive d’un risque pour des installations

En revanche, grande utilité pour l’identification sans ambiguïté des souches de Legionella non pneumophila isolées par culture

- N’agglutinant pas avec les tests disponibles mais possédant les caractères de Legionella
- Confirmation du genre en 4h
- Envoi au CNR pour confirmation du genre et identification de l’espèce si nécessaire : 1/50 résultat non concordant avec le CNR avec une souche issue d’une eau minérale sulfurée
- De même, identification des souches de Staphylococcus aureus isolées par culture

Conclusion

La qRT-PCR est une méthode aujourd’hui fiable et validée grâce aux travaux de la normalisation
Facile à mettre en oeuvre du fait de l’existence de kits commerciaux performants et validés
Complément utile des techniques traditionnelles par sa très grande spécificité  

Outil d’avenir qui a déjà modifié les pratiques des laboratoires